分離度方程式可以確定影響分離度的參數(shù)：柱效（N）、容量因子（k）和選擇性（α）。
在過去幾年里，柱效和使用超高效色譜柱（被稱為“UHPLC”色譜柱）作為實現(xiàn)分離目標(biāo)的手段已得到了極大的重視。
UHPLC已通過更快速的分離和更快速的方法開發(fā)提高實驗室生產(chǎn)力來證明了其價值。
然而，選擇性往往被忽視，且其重要性也被強(qiáng)調(diào)柱效所掩蓋。這是令人遺憾的。
在影響分離度的三個參數(shù)中，選擇性是最為重要的。
（參見圖1）通過利用柱效和選擇性，通常可以實現(xiàn)更好和更快的分離。
圖 1：N、α和k對分離度（Rs）的影響
提高N，α或k可以提高分離度（Rs）。
然而，從這些圖中可以看出，隨著N或k值的提高，對分離度的改善效果也逐漸降低。
另一方面，提高選擇性（α）則沒有這個問題，因此其成為開發(fā)分離方法時的最佳優(yōu)化變量。
在反相色譜中，固定相與分析物之間存在多種相互作用的機(jī)制，這可以用來實現(xiàn)分離。
這些相互作用機(jī)制包括：疏水性結(jié)合、π-π、氫鍵、偶極-偶極和形狀選擇性。
不同類型的鍵合相將提供其中一種或多種相互作用機(jī)制。表1列出了ACE鍵合相和每種可能的主要相互作用機(jī)制，這取決于分析物和流動相條件。
表1: 比較不同鍵合相的分離機(jī)制/相互作用
|
ACE 鍵合相 |
疏水性結(jié)合 |
π–π |
氫鍵結(jié)合 |
偶極-偶極 |
形狀選擇性 |
|
C18 |
強(qiáng) |
無 |
無 |
無 |
弱 |
|
C18-HL |
極強(qiáng) |
無 |
無 |
無 |
弱 |
|
C18-AR |
強(qiáng) |
強(qiáng) |
中等 |
中等 |
中等 |
|
C18-PFP |
強(qiáng) |
強(qiáng) |
強(qiáng) |
強(qiáng) |
強(qiáng) |
|
AQ |
中等 |
無 |
中等 |
弱 |
無 |
|
C8 |
中等 |
無 |
無 |
無 |
無 |
|
C4 |
弱 |
無 |
無 |
無 |
無 |
|
苯基 |
中等 |
強(qiáng) |
弱 |
中等 |
弱 |
|
CN |
弱 |
無 |
弱 |
強(qiáng) |
無 |
利用鍵合相的選擇性實現(xiàn)更好的分離。
圖2表明了兩種ACE鍵合相即C18-AR與苯基之間的選擇性差異。
盡管兩種鍵合相提供了強(qiáng)π-π和偶極-偶極相互作用的可能性，但是在其它可能的相互作用機(jī)制（特別是疏水性結(jié)合）的強(qiáng)度方面，它們存在顯著差異。
C18-AR可能具有其它不同的分離機(jī)制，可以為復(fù)雜的混合物帶來更好的分離效果。對于其他混合物，可能不是這種情況，這是ACE鍵合相的優(yōu)勢。
當(dāng)開發(fā)分離方法時，ACE鍵合相可以提供各種可供選擇的重要保留機(jī)制。
非常強(qiáng)大且獨(dú)特的C18-AR和C18-PFP相只有在ACE和ACE Excel色譜柱中可以獲得。
通過利用柱效和選擇性，可以實現(xiàn)更好的分離。
圖 2：C18-AR與苯基相之間選擇性差異的比較
色譜柱尺寸： 50 x 2.1 mm, 3 μm
流動相：
A= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于水中）；
B= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于甲醇/水中：65:35, v/v）
流速： 0.6 mL/min
溫度： 60 ℃
檢測： UV 214 nm
梯度： 5分鐘內(nèi)從3至100%B，并持續(xù)1分鐘。
樣品：
1. 甲硝唑
2. 3-羥基苯甲酸
3. 苯酚
4. 苯甲醇
5. 咖啡因
6. 水楊酸
7. 喹喔啉
8. 苯甲酸
9. 奎寧
10. 非那西丁
11. 1,4-二硝基苯
12. 1,3,5-三硝基苯
13. 呋塞米
14. 1,3,5 -三甲氧基苯
15. 吡羅昔康
16. 卡維地洛
17. 苯甲酸乙酯
18. 去甲替林
C18-AR相的疏水性更大，這可以為色譜峰對（13,14）和（15,17）提供更多的保留值和更佳的選擇性。還要注意C18-AR與苯基相的洗脫順序有很多變化。
圖3給出了鍵合相選擇能力的另一實例。
一個分離是用C18鍵合相的UHPLC色譜柱完成，另一個分離是用C18-PFP鍵合相的UHPLC色譜柱完成。
C18-PFP鍵合相提供的額外分離機(jī)制，使得總體分離效果更佳出色。
圖 3：ACE Excel可以獲得卓越的分離度和峰形：藥物及其相關(guān)物質(zhì)的UHPLC結(jié)果
條件
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm
流動相：
A = 5mM甲酸（溶于水中）
B = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
梯度：5分鐘內(nèi)從3至100%B
流速：0.6 mL/min
溫度：40 ℃
檢測：UV 254 nm
樣品
1. 對乙酰氨基酚
2. 氫氯噻嗪
3. 甲基苯基亞砜
4. 甲基苯砜
在C18 UHPLC色譜柱和C18-PFP色譜柱上同樣快速地產(chǎn)生色譜圖。
然而，C18-PFP色譜柱可以為色譜峰對（13,14）和（15,17）提供更佳的選擇性，因此能夠提供優(yōu)越的總體分離性能。
