樣品稀釋劑在HILIC中的重要性
引言
當使用親水相互作用液相色譜法（HILIC）時，樣品稀釋劑的選擇對峰形有顯著的影響。稀釋劑的錯誤選擇可能會導致色譜峰形差，峰分裂和保留時間的不穩定。
這張ACE知識卡片探討了在HILIC方法開發過程中如何確定合適的稀釋劑。
樣品稀釋劑與峰形
理想情況下，HILIC模式下樣品的稀釋劑應該盡可能的接近分離化合物的流動相組成，即稀釋劑由高比例的弱溶劑組成，如乙腈。對HILIC模式下梯度洗脫，樣品稀釋劑應該類似梯度方法流動相的起始條件。在某些情況下，可能會出現這種情況，極性化合物的樣品溶解度問題：在HILIC中可能會遇到分析物相對不溶于高濃度的有機溶劑。
有時候，遇到HILIC峰形問題可以通過樣品稀釋劑的選擇來解決。樣品溶解在含高水稀釋劑中是否為問題源頭，因為水是強溶劑，洗脫能力強。樣品被大量水包圍，破壞了化合物分配到HILIC固定相表面富水層的機制。這就導致了化合物較差的峰形和保留時間的不穩定，尤其是保留較弱的化合物。圖1 顯示了2-脫氧尿苷分別用流動相和水做稀釋劑獲得的峰形圖。當被分析物溶解在水里，觀察到峰寬很大，幾乎裂開的峰。通過用流動相來改變樣品的稀釋液，峰的形狀和信號強度得到顯著的改善。
HILIC色譜法，樣品的稀釋劑選擇視具體應用而定，因此在方法開發中，應分配資源研究樣品稀釋劑的影響，通常是稀釋劑的作用強度影響可能依賴于分析物，還受固定相和洗脫液的條件的影響。因此建議進行分步調查來探究提高有機溶劑的比例對于峰形和方法的影響。在50 - 90%乙腈中以增加10%的乙腈量增加：緩沖液可以幫助理解如何實現目標分析物的最佳峰形。
圖1.樣品稀釋劑對于2-脫氧尿苷峰形的影響
色譜柱：ACE 5 HILIC-N, 150 x4.6mm.流速：1.5mL/min。流動相：10 mM 甲酸銨 pH4.7 in乙腈：水=9：1。進樣量：5uL.。溫度：25℃。 檢測器：UV，254nm。
圖2顯示了在流動相pH 3.0 條件下，堿性、酸性和中性分析物的樣品稀釋劑對于三個ACE HILIC固定相（ACE HILIC-A、ACE HILIC-B、ACE HILIC-N）的影響的研究結果。樣品稀釋劑為乙腈和水的混合溶液，水的百分率介于0-100%之間。
次黃嘌呤（極性中性）的峰形一般隨著乙腈濃度的增加而改善，最佳的有機溶劑含量在60-80%左右。酪胺(堿性)在低百分比有機相稀釋劑條件下，HILIC-B和HILIC-N上出現分裂峰， HILIC-A峰形很差。當乙腈的濃度大于60%，峰形得到顯著的改善。扁桃酸的峰形在HILIC-B和HILIC-N相上受稀釋劑的影響較小，而對于HILIC-A相，在高水濃度下峰形較差。總的來說，從這個數據集合來看，對于這個應用，樣品推薦使用由60-80%有機相組成的稀釋劑。
圖2：次黃嘌呤、酪胺和扁桃酸在（a）ACE 5 HILIC-N、（b）ACE 5 HILIC-A、（c）ACE 5 HILIC-B，150 x 4.6mm。在乙腈：水（90：10 v/v）甲酸銨調溶液pH 3.0。流速：1.5mL/min。溫度：25℃。檢測器：UV，254nm。進樣量：5uL。
結論：
樣品稀釋劑的選擇對峰形和方法有重要影響。一般來說，就是樣本稀釋劑應由盡可能高比例的較弱的流動相溶劑(HILIC模式中通常是乙腈)組成。應盡可能避免使用含高比例水的樣品稀釋劑。對于一個給定的應用，一個系統的樣品稀釋劑評估，可以幫助消除任何不良峰形的影響。
